Система освещения микроскопа состоит из источника света (галогенная или светодиодная лампа и источник питания) и оптомеханической системы (коллектор, конденсор, регулируемое поле и апертурная/диафрагма).
Устройство светового микроскопа
Микроскоп (от греч. mikros = маленький и skopeo = смотреть) — это оптический прибор для увеличения мелких предметов и их деталей, которые не видны невооруженным глазом.
Первый известный микроскоп был разработан в Нидерландах в 1590 году потомственными оптиками Сачариасом и Хансом Янсеном, которые установили две выпуклые линзы в одну трубку. Позже Декарт описал более сложный микроскоп в своей книге «Диоптрика» (1637), который состоял из двух линз, одной плоскоконической (окуляр) и одной двояковыпуклой (объектив). Дальнейшие усовершенствования в оптике позволили Антони ван Левенгуку в 1674 году сконструировать линзы с достаточным увеличением для простых научных наблюдений, а в 1683 году он первым описал микроорганизмы.
Современный микроскоп (рис. 1) состоит из трех основных частей: оптики, осветителя и механической части.
Основными компонентами оптической части микроскопа являются две системы увеличительных линз: окуляр, который смотрит в глаз исследователя, и объектив, который смотрит на образец. Окуляры имеют две линзы: верхнюю — главную и нижнюю — сходящуюся. На линзах окуляра указано увеличение (×5, ×7, ×10, ×15) в кадре. Количество окуляров в микроскопе может быть разным. Например, существуют монокулярные и бинокулярные микроскопы (для наблюдения за объектом одним или двумя глазами), а также триокулярные микроскопы, которые позволяют подключать к микроскопу системы документирования (фото- и видеокамеры).
Линзы представляют собой систему линз, заключенных в металлический цилиндр, в котором передняя линза обеспечивает увеличение, а расположенные за ней корректирующие линзы исправляют оптические дефекты. Цифры на оправе объективов также указывают на их увеличение (×8, ×10, ×40, ×100). Большинство моделей, предназначенных для микробиологических исследований, имеют несколько объективов с различными уровнями увеличения и вращающийся механизм для быстрой смены объективов, часто называемый «турелью».
Осветительное устройство предназначено для создания светового потока, который освещает объект таким образом, чтобы оптическая часть микроскопа могла выполнять свои функции с максимальной точностью. Осветительная часть транзитного микроскопа расположена за объектом под объективом и включает в себя источник света (лампу и источник питания) и оптико-механическую систему (конденсор, полевую диафрагму и регулируемую диафрагму). Конденсор состоит из системы линз, которые собирают лучи источника света в одной точке — фокальной, которая должна находиться в плоскости исследуемого объекта. Под конденсором, в свою очередь, находится диафрагма, с помощью которой можно регулировать (усиливать или уменьшать) световой поток, исходящий от источника света.
Темнопольная и фазово-контрастная микроскопия
Возможность наблюдения микроорганизмов в живом (бесцветном) состоянии предоставляет темнопольная микроскопия и фазово-контрастная микроскопия, которые требуют специальных конденсоров и позволяют получать черно-белые изображения исследуемых микроорганизмов, с возможностью изучения их формы, подвижности, расщепления и т.д.
Темнопольная микроскопия основана на эффекте Тиндалла. Известным примером является обнаружение частиц пыли в воздухе при освещении узким солнечным лучом. Этот вид микроскопии был впервые предложен в 1903 году австрийскими учеными Р. Зигмонди и Р. Зидентопфом. Объект освещается не снизу, а сбоку, поэтому прямые лучи осветителя не попадают на объектив микроскопа и поле зрения остается темным. Этот тип освещения достигается с помощью специального конденсатора темного поля (параболического или кардиоидного) с темной центральной частью.
Чтобы прямые лучи осветителя не попадали в объектив, апертура объектива должна быть меньше апертуры конденсора (апертура уменьшается путем присоединения диафрагмы к обычному объективу или с помощью специальных объективов, оснащенных ирисовой диафрагмой). В свою очередь, объект освещается боковыми лучами, и только лучи, рассеянные частицами образца, попадают на объектив микроскопа. Это объясняет, почему микроорганизмы в темнопольном микроскопе выглядят ярко освещенными на черном фоне (рис. 3). Однако одним из ограничений микроскопии в темном поле является то, что можно увидеть только контуры объекта, но нельзя изучить его внутреннюю структуру.
Метод фазово-контрастной микроскопии, который также предназначен для наблюдения микроорганизмов в живом (неокрашенном) состоянии, основан на другом физическом принципе, впервые предложенном Ф. Цернике в 1935 году (Нобелевская премия по физике 1953 года). Она заключается в том, что при нормальных условиях, когда луч света проходит через неокрашенный объект, отличающийся от окружающей среды только показателем преломления, меняется только фаза колебания световой волны, что не воспринимается человеческим глазом.
Для контрастирования изображения изменение фазы световой волны должно быть преобразовано в видимую амплитуду, что достигается с помощью специального фазово-контрастного устройства. Основными компонентами такого устройства, которое может быть установлено на любой световой микроскоп, являются конденсор фазового контраста и фазовый объектив. Конденсор фазового контраста представляет собой вращающийся узел с круглыми апертурами, которые освещают образец полным конусом света, соответствующим фазовым пластинам в каждом объективе.
Фазовые линзы, в свою очередь, отличаются от обычных линз тем, что в их главной фокальной точке находится кольцевая фазовая пластина, которая изготавливается путем нанесения на линзу редкоземельных солей. При этом освещение регулируется таким образом, чтобы весь свет, проходящий через кольцевую апертуру конденсора, проходил через фазовое кольцо, которое является
Люминесцентная (флюоресцентная) микроскопия
Основы люминесцентной микроскопии были заложены А. Келером, который установил основные возможности этого метода исследования. Первый аппарат для этого метода был разработан в 1911 году, но широкое применение он нашел лишь два десятилетия спустя, когда для окрашивания препаратов стали использовать флуоресцентные красители, поскольку они избирательно связывались с определенными клеточными структурами (М. Хайтингер, 1933-1935). Позже было предложено соединение флуорохромов с антителами, что положило начало методу иммунофлуоресценции (A.N. Koons, 1942). В бывшем СССР М.Н. Майзель (1953) внес важный вклад в разработку метода люминесцентной микроскопии и в производство отечественной промышленностью люминесцентных микроскопов и приборов, основанных на этом принципе.
Люминесцентная микроскопия (от лат. lumen — свет; греч. micros — маленький + skopeo — рассматривать) основана на принципе люминесценции (свечения, видимого глазом) микроорганизмов, клеток, тканей или отдельных структур. Физическая основа возникновения люминесценции связана с процессом поглощения падающего света определенными молекулами и последующим испусканием квантов с различными (более длинными) длинами волн (правило Стокса).
Первичная (эндогенная) флуоресценция возникает без специальной лекарственной обработки и присуща многим биологически активным веществам, например, ароматическим аминокислотам, порфиринам, хлорофиллу, витаминам А, В2 и В1, некоторым антибиотикам (тетрациклину) и химиотерапевтическим средствам (акрихин, рибанол). Вторичная (индуцированная) флуоресценция возникает в результате обработки микроскопических объектов флуоресцентными пигментами — флуорохромами. Некоторые из этих пигментов диффузно распределены в клетках, в то время как другие избирательно связываются с конкретными клеточными структурами или даже с конкретными химическими веществами.
Для этого вида микроскопии используются специальные флуоресцентные микроскопы, которые отличаются от обычного светового микроскопа тем, что имеют мощный источник света (ртутно-кварцевую или кварцево-галогенную лампу накаливания), излучающий в основном в длинноволновом ультрафиолетовом или коротковолновом видимом (сине-видимом) спектре.
Этот источник используется для возбуждения флуоресценции, после чего излучаемый свет проходит через специальный возбуждающий фильтр (сине-фиолетовый) и отражается от пластины интерференционного светоделителя, который отсекает почти все более длинные волны и пропускает только ту часть спектра, которая возбуждает флуоресценцию. В современных люминесцентных микроскопах возбуждающее излучение попадает на образец через объектив (!). После возбуждения флуоресценции результирующий свет снова попадает в объектив и проходит через фильтр (желтый) перед окуляром, который отсекает коротковолновое возбуждающее излучение и позволяет свету люминесценции пройти через образец к глазу наблюдателя.
История создания
Это стало известно после заявления младшего Янсена в середине XVII века. Существует версия, согласно которой первая конструкция выпуклых и вогнутых линз была разработана знаменитым Галилео Галилеем в начале 17 века. Десять лет спустя К. Дреббель построил прибор с двумя выпуклыми линзами, с помощью которого он использовал две увеличительные линзы.
Несколько лет спустя голландец К. Гюйгенс, создавший окуляр для телескопа, разработал и построил систему с двумя линзами, которые можно было регулировать без разделения света на отдельные цвета. Это изобретение стало настоящей революцией в истории оптических технологий, а окуляры Гюйгенса используются и по сей день.
Важную роль в развитии оптических приборов сыграл знаменитый основатель научной микроскопии Левенгук. Он собирал небольшие приборы с одним мощным объективом. Хотя простые конструкции были очень неудобны, они позволяли рассматривать изображения предметов более детально, чем сложные устройства.
За всю историю развития микроскопной техники было изобретено множество устройств. Все они различались по конструкции и принципу действия. Основные типы микроскопов:
Виды микроскопов
Самым простым и дешевым устройством является оптический прибор. С точки зрения технических параметров, вы можете увеличить изображение объекта в две тысячи раз. Из-за большого количества для исследования можно использовать световой микроскоп:
- оптические;
- электронные;
- сканирующие зондовые;
- рентгеновские.
Оптические и электронные
Приборы с таким увеличением имеют более высокое качество и поэтому довольно дороги. Большинство приборов имеют простую конструкцию и малое увеличение. В основном они используются в учебных целях в лаборатории биологии. Устройства обычно имеют несколько подвижных линз с разным увеличением, которые можно менять в зависимости от задачи.
- структуру клеток;
- поверхность ткани;
- дефекты на искусственных объектах и т. д.
Еще более совершенным прибором является электронный микроскоп, который может увеличивать объект в 20 000 раз. Разница между этим и оптическим устройством заключается в том, что вместо пучка света используется электронный луч. Специальные магнитные линзы преобразуют движение отрицательно заряженных частиц в изображение, а направление луча контролируется изменением магнитного поля.
Используя устройство в сочетании с компьютером, можно значительно увеличить изображение и одновременно сфотографировать объект. Недостатками этих устройств считаются их высокая стоимость и работа только в лабораторных условиях, так как молекулы воздуха влияют на электроны и ухудшают резкость изображения. Чтобы предотвратить воздействие на микроскоп внешних магнитных полей, лаборатории расположены в подземных бункерах с толстыми стенами.
Сканирующее оборудование позволяет получить желаемое изображение с помощью специального детектора, который действует как линза и рассматривает объект. Сканирующее устройство представляет собой
Зондовые и рентгеновские
Рентгеновские микроскопы используются для исследования объектов, размеры которых соответствуют длинам волн электромагнитного излучения от 10 до 0,001 нм. Эти устройства по своим характеристикам и эффективности находятся между оптическими и электронными устройствами. Рентгеновские волны могут проникать сквозь поверхность объекта и позволяют определить не только структуру, но и химический состав объекта.
Все микроскопы делятся на различные категории сложности, всего их 6, первая включает простые конструкции, а вторая — самые сложные. Конструкция микроскопа зависит от его типа и назначения. Чтобы ознакомиться с наиболее важными частями оптического прибора, достаточно знать устройство простейшего лабораторного прибора.
Рисунок (раскраска) карандашом — строение микроскопа с этикетками. Маркировка узлов схемы:
Строение приборов
В более старых моделях зеркала служат отражателями света, а вместо зажимов используется стекло. Основными компонентами микроскопа являются объектив и окуляр, которые являются наиболее важными частями оптической системы. Этот блок используется для создания изображения объекта. Для изменения увеличения в профессиональных приборах подбираются различные комбинации окуляров и объективов.
Чтобы найти увеличение микроскопа, умножьте соответствующее значение окуляра на значение объектива. Механическая часть прибора включает в себя трубу, стойку, сцену, систему фокусировки и турель. Фокусировка осуществляется двумя винтами (грубая и точная регулировка), что позволяет быстро настроить резкость объекта.
- Окуляр.
- Тубус.
- Штатив.
- Винт грубой настройки фокуса.
- Винт тонкой регулировки.
- Основание.
- Насадка.
- Объективы.
- Зажимы.
- Предметный столик.
- Конденсор с диафрагмой.
- Осветитель.
В некоторых конструкциях регулировка осуществляется путем перемещения шкалы, в других — путем перемещения ствола. Профессиональные микроскопы обычно оснащены съемными объективами, которые можно свинчивать между собой. Важную роль в оптическом приборе играет осветительная система, которая состоит из источника света, конденсора и диафрагмы.
Конденсор, состоящий из линз или зеркал, используется для сбора световых лучей и направления их на исследуемый объект. Он может состоять из одной, двух или трех линз. Поднимая или опуская устройство, пользователь фокусирует или рассеивает свет, падающий на объект. Яркость плавно регулируется с помощью диафрагмы, обычно в виде ирисовой диафрагмы. Источник света может быть встроенным или внешним, а сложные конструкции имеют более одной подсветки.
Основной класс приборов, на которых мы остановимся, — это так называемые биологические микроскопы, в английской терминологии «compound», от «compound», и используются для изучения тонких прозрачных образцов (срезов тканей, бактерий, микроорганизмов и т.д.) в проходящем свете. Образец
Следует понимать, что таракана трудно поместить под биологический микроскоп: Для сильной оптики, где расстояние между линзой и образцом составляет буквально десятые доли миллиметра, образец должен быть очень тонким, плоским и прозрачным, специально подготовленным и, возможно, окрашенным. Обычно это капля или тонкая пленка, помещенная между предметным стеклом и пластиной с образцом. Под объектив для съемки в условиях недостаточного освещения подойдет таракан (его фокусное расстояние составляет от нескольких миллиметров до нескольких сантиметров). Однако следует убедиться, что у вас есть хороший внешний источник света, и не ожидать большой глубины резкости: вы всегда сможете четко видеть только определенную плоскость изображения.
Биологические микроскопы
Типичный биологический микроскоп состоит из трех частей: механической платформы (основания, столика, устройств наведения и фокусировки), осветительной и оптической систем.
Рисунок 3. Микроскоп Celestron (фото производителя).
Механическая система состоит из основания, на котором установлены все остальные компоненты, и подставки, на которую помещается образец. Очень важной частью механизма является система, отвечающая за перемещение ступени с образцом в трех измерениях — именно так образец фокусируется на неподвижном объективе. Существуют модели, в которых объективная линза перемещается, но это редкое экзотическое явление. Устройства начального уровня имеют самые примитивные механизмы. Имеется только грубая регулировка высоты (фокусировка), а перемещение объекта в плоскости осуществляется пальцами.
В более сложных моделях, помимо грубой фокусировки, имеется также точная фокусировка и зажим, перемещающий слайд в горизонтальной плоскости (его подвижная сторона имеет характерную форму полумесяца; это хорошо видно на фотографиях приборов). В самых простых микроскопах вертикальное перемещение регулируется с помощью различных винтов/ручек, а в более совершенных микроскопах они объединены в одну ось. В микроскопах без точной фокусировки существует реальная опасность раздавить объективное стекло и линзу неловким движением руки.
Механическая платформа
Материал корпуса — пластик или металл. Пластик легче, но и более хрупок. Он обычно используется для мобильных моделей для детей или в полевых лабораториях, где важно минимизировать вес. Металл используется для неподвижных микроскопов: Он не только более стабилен, но и менее подвержен вибрации, что крайне важно при больших увеличениях. Металлический микроскоп весит 3-4 кг.
В прошлом основание микроскопа состояло из неподвижного основания и подвижного кронштейна, который позволял изменять ориентацию микроскопа относительно вертикали. Это было
В прошлом для освещения использовалось вогнутое зеркало, помещенное под отверстием сцены. Однако трудно добиться хорошего равномерного освещения поля зрения, что имеет решающее значение при больших увеличениях. Кроме того, на расположение микроскопа по отношению к источнику света, а также на сам источник света накладываются очень строгие ограничения. Сегодня такое зеркало присутствует только в самых примитивных приборах, обычно в полевых микроскопах или детских микроскопах, как в «Натуралисте», показанном в начале. Иногда, однако, он может быть предложен в качестве дополнительной опции и заменять основной источник света.
В настоящее время для освещения используются различные типы ламп, встроенных в основание. До относительно недавнего времени использовались галогенные лампы или лампы накаливания, но у них были свои проблемы. В основном это было связано с тем, что свет производился тонкой нитью накаливания и должен был проецироваться на круглое поле, что, в свою очередь, приводило к проблемам с однородностью. Однако в настоящее время в промышленности широко используются светодиодные источники света, что позволило устранить эту проблему.
Питание подсветки осуществляется либо от батареек (такие микроскопы особенно удобны для детей, так как их можно брать с собой куда угодно), либо от штекерного кабеля. Если вы заказываете проводной прибор из-за границы, вам следует подумать о переходниках для штепсельных вилок.
Электрические компоненты
Освещение контролируется как интенсивностью лампы, так и световым конденсором под рабочим столом, который имеет диафрагму и линзу для фокусировки света на образце. В недорогих моделях чаще всего используется конденсор Аббе или его модификации, это обозначение часто встречается в описаниях микроскопов. Для любителей обычно используется освещение «светлого поля» (т.е. прозрачные объекты, проецируемые на яркий белый фон), но существуют и другие типы: «темное поле», которое дает перевернутое изображение, флуоресцентный свет и т.д. Конденсор является сменным, что позволяет использовать различные типы освещения в одном и том же микроскопе.
Существуют также модели с дополнительной подсветкой сверху, как на фотографии ниже (своеобразный гибрид био- и стереомикроскопа), но это обычно удел любительского оборудования и низких увеличений: сильные объективы, которые по сути выступают в покровное стекло, просто заслоняют верхнюю подсветку. На практике, даже при хорошем наружном освещении, вы почти ничего не увидите с сорокакратным объективом, в то время как стократный объектив показывает полную темноту.
Кстати, в изобразительном микроскопе нет полноценного конденсора, а есть только источник света и диафрагма. Стадия образца имеет только самые примитивные держатели для предметного стекла; перемещение образца в плоскости
